Принята в печать новая публикация сотрудников Международной лаборатории микрофизиологических систем
В работе показано, что дизайн shRNA влияет на ее процессирование РНКазой III Dicer и может способствовать образованию нежелательных 5’-изофром miRNA/siRNA, закодированных в составе shRNA. Особенно значимо этот эффект проявляется для miRNA/siRNA длиной более 19 н.
_v3.jpg "Graphical abstract")
shRNA-опосредованная стратегия сверхэкспрессии микроРНК, основанная на кассетах экспрессии РНК-полимеразы III (Pol III), широко используется для функциональных исследований микроРНК. Для некоторых микроРНК, например, закодированных в геноме в составе полицистронного кластера, такая стратерия - едва ли не единственный путь для их стабильной индивидуальной сверхэкспрессии. Однако в нашем исследовании мы обнаружили, что экспрессия микроРНК длиной более 19 нт (например, hsa-miR-93-5p длиной 23 нт) с использованием такого подхода может сопровождаться нежелательным преобладающим образованием 5'-концевых изоформ микроРНК (5′-isomiR). Дополнительные остатки U, добавляемые Pol III на 3'-конце транскрибируемой shRNA во время терминации транскрипции, могут вызывать сдвиг в положении расщепления Dicer shRNA. Это приводит к образованию 5'-isomiR, которые имеют существенно измененную поледовательность seed-региона, ответственного за выбор мРНК-мишеней микроРНК (по сравнению с первоначально кодируемой канонической hsa-miR-93-5p). Также мы показали, что широко используемый метод qPCR нечувствителен к образованию 5'-изомиР и не может быть использован для подтверждения сверхэкспрессии микроРНК. Однако секвенирование микроРНК позволяет выявить преобладающую экспрессию 5′-isomiR. Более того, данные секвенирования мРНК показали, что 5′-isomiR hsa-miR-93-5p предположительно регулируют свои собственные мРНК-мишени. Таким образом, отсутствие miRNA-Seq может привести к ошибочным выводам относительно выявленных мишеней мРНК и возможных молекулярных механизмов, в которых участвует изучаемая микроРНК. Представленные результаты показывают, что дизайн структуры shRNA для стабильной сверхэкспрессии микроРНК/siRNA требует тщательной проработки, поскольку возможно образования нежелательных 5′-isomiR.